Клеточные технологии в неврологии

Клеточные технологии в неврологии
Поделитесь с друзьями
Поделиться в whatsapp
Поделиться в telegram
Поделиться в odnoklassniki
Поделиться в vk
Поделиться в facebook
Поделиться в twitter
Поделиться в google
Поделиться в email

  Более 100 лет назад, в начале XX века была предположена связь между вновь формирующимися клетками крови и мезодермальным листком в эмбриогенезе. А.А. Максимов доказал важность костного мозга для кроветворения и ввел в научный язык термин «стволовая клетка».  Позднее советские ученые под руководством А.Я. Фриденштейна описали популяцию клеток костного мозга, обладающую свойством адгезии к пластику и способностью к формированию фибробласт-подобных колоний. Позднее была обнаружена способность этих клеток к мезодермальной дифференцировке (в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях) и предложен термин «мезенхимные стволовые клетки»

  В различных исследованиях была показана способность МСК к трансдифференцировке в клетки эндодермального и эктодермального происхождения. Среди последних особый интерес представляли клетки нервной системы. В нескольких исследованиях показана способность МСК под воздействием различных факторов дифференцироваться в нейроно-, астроцит- и глия-подобные клетки. Также в исследованиях на культурах клеток доказаны нейротрофный и нейропротективный эффект МСК – удалось обнаружить способность этих клеток секретировать два нейротрофных фактора: BDNF и NGF играющих одну из основных ролей в каскаде регулирования и координации роста нейронов. При разработке методов регенеративной терапии в неврологии крайне важную роль играют иммуномодуляторные свойства этих клеток: их способность взаимодействовать с T, B лимфоцитацими и NK клетками. 

  В настоящее время считается, что трансдифференцировка МСК в клетки нервной системы нуждается в дальнейших доказательствах, а наблюдаемые эффекты МСК на миелинизацию волокон, рост аксонов и т.д обусловлены не трансдифференцировкой, а паракринными нейротрофным и иммуномодулирующим эффектами. МСК секретируют очень большое количество различных цитокинов, хемокинов, прочих биологически активных молекул. Они также экспрессируют значительные количества ангиогенных факторов (VEGF, SDF-1), противоапоптотических факторов  IGF, HGF,  Akt-1, а также антиоксидантный фактор – SOD. Данный набор секретируемых молекул в сочетании с нейротрофными факторами и обеспечивает, как сейчас считается влияние МСК  на нерную систему при неврологических заболеваниях.

Нейропротективный эффект МСК in vitro и in vivo.

  В экспериментах на клеточных культурах нейронов и нейроноподобных клеток показано, что при культивировании их совместно с МСК, но не с фибробластами, существенной удлиняется время жизни этих клеток в культуре, а также наблюдается их созревание. Показано, что в таких системах МСК продуцируют высокие количества нейротрофных факторов: VEGF (сосудистный эндотелиальный фактор роста сосудов), HGF (фактор роста гепатоцитов), BDNF (нейротрофический фактор мозга),  NGF (фактор роста нервов). Использование вместо МСК культуральной среды, в которой они росли, приводило к воспроизведению эффекта, что подтверждает паракринный механизм нейротрофного действия МСК.

  В экспериментах на животных также доказан нейропротективный эффект МСК. В экспериментах с повреждением зрительного проводящего пути показано увеличение числа выживающих аксотомированных клеток ганглиев сетчатки. МСК в данном исследовании секретировали иммуномодуляторные и нейротрофные факторы, в частности,  TGF-b, CNTF, BDNF и NT-4. На модели индуцированной фокальной демиелинизации спинного мозга с последующей инъекцией МСК наблюдали ремиелинизацию. При искусственном инсульте введение МСК в/в приводило к снижению апоптотической гибели клеток в поврежденной ткани. В других исследованиях доказано, что введение МСК в гиппокамп мышей приводит к миграции эндогенных нейрональных стволовых клеток  их пролиферации и дифференцировке.

Механизм действия МСК при нейродегенеративных заболеваниях. (из Staff et al., 2019).

Роль иммуномодулирующего действия МСК при заболеваниях нервной системы.

  Основной моделью для изучения влияния МСК-иммуномодуляции на заболевания нервной системы является экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, демиелинизирующее заболевание, моделирующее рассеянный склероз. Показано, что в такой модели инъекции МСК  снижали выраженность клинических симптомов и степень демиелинизации  нейронов  мышей, а также степень инфильтрации лейкоцитами центральной нервной системы. Предполагается, что МСК индуцируют анергию Т-лимфоцитов. Также показано , что МСК мигрируют в центральную нервную систему, где стимулируют выработку BDNF и индуцируют пролиферацию ограниченной популяции предшественников олигодендроцитов. Гистологическими методами показано снижение воспалительной инфильтрации, демиелинизации нервных волокон и утраты аксонов у мышей, которым в данной модели вводили МСК. При этом признаков трансдифференцировки трансплантатов обнаружить не удалось. Хотя в большинстве исследований клетки вводились внутривенно, при сравнении внутривенного метода с интравентрикулярным доказано преимущество последнего в отношении иммуномодуляторного и нейротрофического эффектов МСК на уровне центральной нервной системы. Однако периферический иммуномодуляторный эффект МСК не менее важен. Инъецированные внутривенно МСК мигрируют, в том числе, и в лимфоузлы, легкие и мозг. Предполагается, что в лимфоузлах МСК также участвуют в иммуномодуляторных процессах и тормозят хоуминг Т-клеток в центральной нервной системе.

  Описанные выше эксперименты по оценке иммуномодуляторного эффекта МСК при нейродегенеративных заболеваниях проводятся обычно с аутологичными клетками. Конечно, такая система является наиболее физиологичной, однако, при разработке клинических схем применения необходимо учитывать, что это не всегда возможно – состояние пациента может требовать срочного применения клеточной терапии, не дожидаясь длительного (до 1 мес.) роста клеток в культуре и проведения всех необходимых тестов, или состояние больного может не позволять забор аутологичного материала. В ряде случаев неврологические заболевания связаны с генетическими причинами, что делает нежелательным применение аутологичных клеток. Кроме этого, донорский материал обычно тщательнее охарактеризован (ввиду большего количества времени), и более удобен для крупномасштабного производства. Поэтому использование для трансплантации МСК от здорового донора в ряде случаев может представляться более предпочтительным. Использование аллогенных (донорских) МСК существенно облегчается «иммунопривелигированным» статусом МСК. Такой статус обеспечивается тремя особенностями МСК:  

  1. МСК гипоиммуногенны, поскольку не экспрессируют MHC-II и костимулирующие молекулы;
  2. МСК предотвращают Т-клеточный ответ, модулируя функции дендритных клеток и подавляя работу NK, CD8+, CD4+ клеток
  3. МСК создают иммуносупрессивное микроокружение, синтезируя простагландины и интерлейкин-10.

  Эффективность аллогенных МСК при нейродегенеративных заболеваниях часто объясняют механизмом «однократного удара» (иммуномодуляторного или нейротрофного), который следует непосредственно за введением аллогенных МСК до того, как начнутся какие-либо процессы, связанные с инактивацией донорских МСК (например, атака макрофагами). Ранее считалось, что иммунная система реципиента толерантна к МСК донора ввиду отсутствия экспрессии MHCII. В настоящий момент доказано, что аллогенные МСК все же отторгаются при трансплантации у мышей при отсутствии совмещения по MHCI и MHCII. В основе этого эффекта лежит способность NK и T-клеток атаковать аллогенные МСК. Кроме этого, по некоторым данным, аллогенные МСК также фагоцитируются макрофагами хозяина. При этом терапевтический клеток аллогенных МСК при нейродегенеративных заболеваниях хорошо выражен. Поэтому в настоящее время считается, что эффект от применения МСК основан не на трансдифференцировке и образовании графтов, а на массированном выбросе биологически активных молекул непосредственно после трансплантации 

Доклинический опыт применения МСК на моделях неврологических заболеваний

Нарушения мозгового кровообращения

  В многочисленных публикациях по оценки влияния МСК на процессы регенерации при искусственном нарушении мозгового кровообращения показано, что вводимые клетки  оказываются вблизи поврежденного участка, участвуют в восстановлении контактов между нейронами, повышают количество выживших нейронов. Также показано существенное улучшение показателей животных в поведенческих тестах. В экспериментах с использованием клеточных слоев МСК, накладываемых непосредственно на пораженный участок, показано усиление васкуляризации в области локализации имплантированных МСК, причем как в самом клеточном слое, так и в прилегающей области мозга животного-реципиента с образованием анастомозов между сосудами трансплантата и тканей реципиента.

Анализ формирующейся сети сосудов (красный) и миграции МСК из клеточного слоя (зеленый) в мозге мыши-реципиента на 7 день после накладывания клеточного слоя (монослой МСК) на область с нарушенным кровобращением. Анастомоз сосудов, сформированных в клеточном слое донора, и мозга реципиента показан на нижней панели (стрелки). Изображение взято из Ryu et al., 2019. https://thejns.org/doi/abs/10.3171/2018.11.JNS182331

Болезнь Паркинсона

  На животных моделях удалось получить допамин-продуцирующие нейроны из трансплантированных МСК костного мозга, трансплантированных в полосатое тело. У крыс наблюдалось улучшение показателей поведенческих тестов, а в мигрировавших в полосатое тело меченых МСК экспрессировались маркеры нервных клеток: нейрофиламенты и ключевой фермент синтеза катехоламинов, тирозингидроксилаза. Присутствие инъецированных МСК в полосатом теле показано и при внутривенном введении мышам, у которым болезнь Паркинсона была индуцирована ротеноном. У таких мышей обнаруженные в полосатом теле человеческие клетки экспрессировали допамин, а в pars compacta черной субстанции снижалось число нейронов, содержащих а-синуклеин – маркёр болезни Паркинсона. Показано, что использование модифицированных МСК с более высоким уровнем экспрессии нейротрофных факторов  BDNF, GDNF, VEGF, усиливает терапевтический эффект клеточной терапии.

Болезнь Хантингтона

  В доклинических исследованиях доказана способность МСК улучшать моторные функции и повышать выживаемость животных. Трансплантированные МСК выживали, индуцировали дифференцировку в полосатом теле. Трансплантированные клетки обнаруживали признаки частичной нейрональной дифференцировки, нейротрофного и противоапоптотического эффектов. В одном из экспериментов, после введения МСК наблюдалось поведенческое и анатомическое восстановление животных после индукции болезни Хантингтона хинолином.

Мультисистемная атрофия и боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз.

  Способность МСК улучшать состояние животных при мультисистемной атрофии показана как на различных моделях, в том числе на трансгенных животных.

При моделировании бокового амиотрофического склероза в нескольких исследованиях, интратекальное введение МСК удаляло снижение моторных фукнций и индуцировало нейропротективные процессы. При оценке выживаемости, сохранности моторных функций, гистологии, измерении маркеров оксидативного стресса и выброса [³H]d-аспартата в спинном мозге показано существенное улучшение всех этих параметров.

  Данные по доклиническим исследованиям эффективности МСК при рассеянном склерозе на модели аутоиммунного энцефаломиелита свидетельствуют в пользу эффективности МСК как за счет иммуномодулирующего, так и за счет нейротрофного действия МСК. Показано, что Т-лимфоциты являются главными эффекторами в развитии рассеянного склероза. . Введение МСК снижает инфильтрацию лимфоцитами центральной нервной системы и усиливает Th2 ответ, одновременно снижая Th1 И Th17. Показано также, что МСК оказывают влияние на те субпопуляции лимфоцитов, дерегуляция которых также приводит к развитию аутоиммунного ответа (FOXP3+  Т клетки T cells – Treg; T рег 1 – Tr1 клетки). B-лимфоциты  также участвуют в развитии рассеянного склероза. Введение МСК приводит к снижению выработки антител B_лимфоцитами и индуцирует выработку CD1d(high)CD5(+) B регуляторных клеток.

  Данные полученные in vitro предполагают, что МСК модулируют активацию микроглии, что позволяет ожидать влияние МСК на активацию микроглии in vivo. Активация микроглии наблюдается в модели аутоиммунного энцефаломиелита, где она коррелирует с тяжестью повреждения нейронов. МСК снижают активацию микроглии. Важнейшую роль при этом играет HGF  и его рецептор cMet. 

Влияние клеточной терапии на регенерацию периферических нервных проводников.

  В последнее время разрабатывается технология использования клеточных материалов (клеточных пластов или клеток на носителях) для улучшения регенерации травмированных периферических нейронов. Считается, что влияние МСК на этот процесс связано с дифференцировкой трансплантированных клеток в направлении шванновских клеток, их участие в миелинизации регенерирующих нервных волокон, выработка пересаженными клетками трофических факторов и белков внеклеточного матрикса, способствующих росту аксонов реципиента, стимуляция пролиферации и дифференцировки эндогенных клеток реципиента, стимуляция ангиогенеза, снижение воспалительной реакции в поврежденном нерве.

Экспериментальное повреждение лицевого нерва – контрольный эксперимент и повреждение с последующим оборачиванием нерва клеточным слоем стволовых клеток пульпы зуба (МСК по фенотипу). (A) Гематоксилин-эозин. Контроль – отсутствие клеточного слоя из стволовых клеток, Видно отсутствие структуры нерва в области травмы. Область дефекта под большим увеличением представлена на (A’). (B)анти -тубулин (пурпур) окраска контрольного экспланта показывает, что аксоны контрольного образца прерываются в области дефекта. Разрыв нейрона показан под большим увеличением на (B’). (C) Гематоксилин-эозин окраска нерва после оборачивания клеточным слоем. Видна упорядоченная структура нерва в области дефекта и клеточный слой (обведен черным пунктиром). (C’) - область дефекта под увеличением. (D)окраска антителами к -тубулину (пурпур) показывает наличие аксона, проходящего через область дефекта. Клетки трансплантата окрашены зеленым. Ядра всех клеток окрашены DAPI (синий псевдоцвет). Изображение взято из Ahmed et al., 2020. Dental pulp cell sheets enhance facial nerve regeneration via local neurotrophic factor delivery (DOI: 10.1089/ten.TEA.2020.0265).
Восстановление структуры периферического нерва под действием МСК. Верхняя панель - иммуногистохимическое окрашивание поперечного среза нерва дистальнее области повреждения. Аксоны визуализировали окраской антителами к нейроспецифичным белкам. Нижняя панель – результат статистической обработки данных. Изображение взято из Карагяур М.Н., а/реф на соискание степ. к.биол. н., 2013.

Клинические исследования

  В настоящее время зарегистрировано более 100 клинических исследований по применению МСК области неврологии. По количеству клинических испытаний по применению МСК неврологические заболевания находятся на втором месте после заболеваний костей и суставов. Большинство из них выполняется на взрослых добровольцах. Однако, в случае детского церебрального паралича исследования выполняются на детях. Чаще всего исследования проводятся с использованием аутологичного материала – МСК, выделенных из жировой ткани или костного мозга пациента. В ряде исследований используются МСК, выделенные из тканей пупочного канатика. Донорский материал используется в исследованиях, в которых оценивается возможность применения в острую и подострую фазы неврологического заболевания.  

  Табл. 1. Примеры клинических исследований по применению МСК при лечении неврологических заболеваний (данные из Mucai et al., 2018)

Лит. ИсточникЗаболеваниеИсточник МСКЧисло пациентовВозрастСпособ введенияДоза МСКЧисло инъекцийРезультатПоб. эффекты
Liu X et al. (2017)ДЦПКМ354.12 мес.ИТ1 × 106/кг с интервалом. 3-4 дня4Моторное восстановление через 12 мес)Тошнота, гол. боль, подъем темп.
Vaquero J et al. (2017)Повреждение спинного мозгаКМ1242.2 летИТ3 × 107 с интервалом 3 мес-4Моторное восстановление через 12 мес)Головная боль, боль в месте инъекции
Petrou P et al. (2016)БАСКМ2020–75 летИТ1.0–2.0 × 1061Моторное восстановление через 6 месТошнота, гол. боль, подъем темп.
2.4–4.8 × 107 cells
в/м
Satti H et al. (2016)Повреждение спинного мозгаКМ931.6 летИТ1.2 × 106/кг2 или 3Оценка безопавностиНет
Oh K et al. (2015)БАСКМ845.7 (29–62)ИТ1.2 × 106/кг, интервал 26 дней2Отсутствие снижения индекса ALSFRS-R в течение 6 месНет серьезных побочных эффектов
Mendonça MV et al. (2014)Повреждение спинного мозгаКМ1435.7 (18–65)Прямая инъекция в область1 × 1071Моторное восстановление через 6 месСлабая боль в области разреза
Tsai YA et al. (2017)СЦАЖТ721–66в/в1 × 106/кг1Возможная эффективностьНет
Staff NP et al. (2016)БАСЖТ2736–75ИТ1 × 107, 5 × 107, 5 × 107 × 2, 1 × 108, 1 × 108 × 21 или 2Отсутствие эффектаПри максимальной дозе – боли в спине и ноге
Hur JW et al. (2016)Повреждение спинного мозгаЖТ1441.9ИТ9 × 107 с интервалом 1 мес2Моторное (5/14) и сенсорное восстановление (10/14) 8 мес.Головная боль, тошнота, рвота
Okur SC et al. (2018)ДЦППКн16ИТ1 × 106/кг4Моторное восстановление через 6 месБоли в спине
в/м1 × 106/кг
Wang et al. (2015)ДЦППКн16 (8 двоен)6.29 (3–12)ИТ1–1.5 × 107 с интервалом 3-5 дней4Моторное восставноление через 1 и 6 месНет
Cheng H et al. (2014)Повреждение спинного мозгаПКн1035.3 (19–57)ИТ2 × 107 с интервалом 10 дней2Моторное восстановление (7/10) через 6 месНет
Jin et al. (2013)СЦАПКн1639.9ИТ+в/вИВ: 4 × 1074Моторное восстановление через 6 месНет
ИТ: 2 × 107с интервалом 7 дней
Wang et al. (2013)Травма головного мозгаПКн202021-05-27 00:00:00ИТ1 × 107 с интервалом 5-7 дней4Моторное восстановление через 6 месНет
Huang L et al. (2018)ДЦППКр272021-03-07 00:00:00в/в5 × 107 с интервалом 7 дней4Ярко выраженное моторное восстановление через 3, 6, 12, 24 месяцаНет

Сокращения: БАС – боковой амиотрофический склероз, ДЦП – детский церебральный паралич, ИТ – интратекально, СЦА – спиноцеребеллярная атаксия, КМ – костный мозг, ЖТ – жировая ткань, ПКн – пупочный канатик, ПКр – пуповинная кровь.

Литература по теме

  1. Arutyunyan I, Elchaninov A, Fatkhudinov T, Makarov A, Kananykhina E, Usman N, Bolshakova G, Glinkina V, Goldshtein D, Sukhikh G. Elimination of allogeneic multipotent stromal cells by host macrophages in different models of regeneration. Int J Clin Exp Pathol. 2015 May 1;8(5):4469-80. PMID: 26191137; PMCID: PMC4503009.
  2. Kassis I., Petrou P., Vaknin-Dembinsky A.,  Karussis D. Mesenchymal stem cells in neurological diseases. Clin. Invest. (2013) 3(2), 173–189. DOI 10.4155/CLI.12.145
  3. Laroni, A., Rosbo, N. K. de, & Uccelli, A. (2015). Mesenchymal stem cells for the treatment of neurological diseases: Immunoregulation beyond neuroprotection. Immunology Letters, 168(2), 183–190. doi:10.1016/j.imlet.2015.08.007
  4. Lopatina T, Kalinina N, Karagyaur M, Stambolsky D, Rubina K, et al. (2011) Adipose-Derived Stem Cells Stimulate Regeneration of Peripheral Nerves: BDNF Secreted by These Cells Promotes Nerve Healing and Axon Growth De Novo. PLoS ONE 6(3): e17899. doi:10.1371/journal.pone.0017899
  5. Mukai T, Tojo A, Nagamura-Inoue T. Mesenchymal stromal cells as a potential therapeutic for neurological disorders. Regen Ther. 2018 Aug 24;9:32-37. doi: 10.1016/j.reth.2018.08.001. PMID: 30525073; PMCID: PMC6222283.
  6. Staff NP, Jones DT, Singer W. Mesenchymal Stromal Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Mayo Clin Proc. 2019 May;94(5):892-905. doi: 10.1016/j.mayocp.2019.01.001. PMID: 31054608; PMCID: PMC6643282.
  7. Петрова Е.С. Восстановление поврежденного нерва с помощью клеточной терапии (фундаментальные аспекты).  ACTA NATURAE. ТОМ 7 № 3 (26) 2015. DOI https://doi.org/10.32607/20758251-2015-7-3-38-47

Задать вопрос или оставить отзыв