Тест активации базофилов в диагностике аллергических заболеваний. Обзор

Введение

Тест активации базофилов (англ. basophil activation testing — ВАТ) был разработан в 1990-х годах после открытия молекулы активации базофилов – CD63 [1]. CD63 представляет собой мембранный белок, локализованный в секреторной лизосомной гистамин-содержащей грануле. Базофилы и тучные клетки являются ключевыми эффекторными клетками при аллергических реакциях немедленного типа. Базофилы высвобождают гистамин из гранул при стимуляции аллергеном, к которому они сенсибилизированы. Активация аллергеном базофилов крови может быть оценена либо как высвобождение гистамина – используется в тесте высвобождения гистамина базофилами, при котором гистамин измеряется в супернатанте обычно с помощью ELISA, либо как повышение экспрессии CD63 – используется в тесте активации базофилов. Перемещение CD63 к клеточной мембране во время дегрануляции можно измерить с помощью проточной цитометрии. Регистрация уникальной способности этих клеток дегранулировать при перекрестном связывании специфических IgE с расположенным на поверхности клетки высокоаффинным рецептором IgE (FceRI) под воздействием аллергена, обуславливает клиническую значимость теста активации базофилов [2]. Особое значение тесту придает возможность выявления активации базофилов, происходящей без участия IgE-антител. Базофилы могут активироваться за счет прямой активации, гиперосмолярности, а также с участием системы комплимента или IgG-антител.

Тест активации базофилов (BAT) является функциональным клеточным тестом и относится к Ex vivo тестам (с лат. — «из жизни», «то, что происходит вне организма»), а именно проведение исследования на ткани/клетках, перенесённых из организма в искусственную внешнюю среду. Эксперименты ex vivo, как правило, проводятся in vitro, однако два эти термина не являются синонимами. По сравнению с определением специфического IgE в сыворотке, BAT отражает функциональный ответ, так как активация базофилов может быть вызвана перекрестным связыванием с FceRI (2а). Плотность комплексов FceRI-IgE на базофилах и тучных клетках определяется концентрацией свободного IgE в крови [3]. 

Помимо CD63 идентифицирован ряд других маркеров активации, среди них CD203c [4]. По некоторым данным CD203c, по-видимому, коэкспрессируется с CD63, но пути их активации различаются [5]. В соответствии с согласительным документом EAACI, посвященном применению ВАТ в диагностике аллергических заболеваний [2], тест активации с CD63 является лучшим клинически подтвержденным тестом [5-7], однако тест на основе CD203c также демонстрирует свою надежность и применяется в настоящее время [8-10]. В РФ доступны диагностические наборы как с CD63, так и с CD203c, а также набор, включающий в себя оба маркера.

Особенности преаналитического этапа BAT

В качестве отрицательного контроля используется буфер PBS¹ или буфер, содержащий кальций, гепарин и ИЛ-3. Базофилы цельной крови при взаимодействии с ЭДТА², которая является хелатирующим агентом сорбирующим ионы, в том числе ионы кальция, утрачивают способность к активации. Для восстановления этой способности необходимо добавление кальция. Гепаринизированная кровь не требует этого дополнительного преаналитического этапа. Однако, использование ЭДТА в качестве антикоагулянта имеет свое объяснение – временная утрата базофилами способности к активации помогает избежать спонтанной активации базофилов на преаналитическом этапе. Наполнение пробирки кровью должно быть достаточным — не менее половины объема, для исключения повышения концентрации ЭДТА и, соответственно, искажения результата.

В литературе встречаются данные о том, что тест активации базофилов следует проводить незамедлительно после получения образца крови или в течение 4 часов. В 2018 году на EUROBAT представителем исследовательской группы лаборатории Bühlmann был сделан доклад на тему стабильности крови для ВАТ — «Blood Stability for BAT test», в котором приводятся данные анализа трех антикоагулянтов крови (гепарин, ЭДТА, цитрат) и различные варианты температуры хранения образцов до исследования (2-8˚С, 20˚С и 28˚С) [11]. Обнаружено, что базофилы могут быть восстановлены не только сразу после взятия крови, но и через несколько суток после при использовании любого антикоагулянта. Оптимальная эффективность восстановления наблюдалась в образцах с ЭДТА при температурном режиме хранения 2-8˚С. При этой температуре потеря клеток сводится к минимуму с восстановлением более 500 базофилов, что является порогом для получения статистически значимого количества клеток для надежных данных BAT. Кровь с ЭДТА, хранившаяся при 2-8 °C, превосходила гепарин и цитратную кровь, где исследователям удалось извлечь только среднее количество базофилов — между 300 и 500. Что касается активности базофилов, то проведенное исследование демонстрирует минимальную потерю активационной способности через 24/48 часов после отбора проб. Лекарственные аллергены редко вызывают активацию, превышающую 20-30%, поэтому предлагается проводить тестирование BAT в течение 24 часов, чтобы ограничить возможность потери реактивности и получения ложноотрицательных результатов. Для белковых аллергенов, с учетом их более высокой реактогенности, интервал запуска пробы в работу составляет до 48 часов от момента взятия биоматериала. 

Транспортировка крови для теста активации базофилов стала рутинным явлением в европейских странах. Базофилы оказались более стабильны, чем считалось ранее. Общество Instand e.V., располагающееся в Германии, организует EQA тесты (external quality assessment – внешняя оценка качества), отправляя образцы цельной крови участнику, которые он получит в течении 24 часов для проведения ВАТ.

Антигистаминные препараты не влияют на тест активации базофилов [12], но следует избегать применения стероидных гормонов [12] и циклоспорина А [13]. Образцы крови для исследования предпочтительно брать в течение 1 года после последнего контакта с предполагаемым аллергеном [14,15]. Оптимальным сроком для проведения исследования является интервал от 3 до 12 недель после аллергической реакции на предполагаемый аллерген, хотя специфическая базофильная реакция часто сохраняется в течение более длительного периода времени.

Для предотвращения контаминации аллергенами до и во время стимуляции аллергеном пробирки с образцами и окна в лабораторном помещении должны быть закрыты. Тест проводится с использованием ламинарного шкафа. Латексные перчатки не используются.

¹PBS (англ. Phosphate buffered saline-Натрий-фосфатный буфер) — буферный раствор, используемый в биологических исследованиях. Представляет собой водный раствор солей, содержащий хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия.

²Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА от англ. EDTA) — органическое соединение, четырёхосновная карбоновая кислота 

Аллергены для проведения ВАТ

В согласительном документе EAACI, посвященном применению ВАТ в диагностике аллергических заболеваний, рекомендуется использовать стандартизованные аллергены при их наличии. В настоящее время только одна компания производит стандартизованные аллергены для ВАТ – пищевые, ингаляционные, грибковые, яды насекомых, лекарственные и профессиональные аллергены, а также пищевые добавки. Эти стандартизованные аллергены имеют значительный недостаток – они находятся в лиофилизированном виде и после восстановления должны быть использованы немедленно и не могут храниться. Это связано с нестабильностью раствора в виду отсутствия в составе консерванта и стабилизатора. Исключение составляют только восстановленные аллергены яда пчелы и яда осы, они могут храниться до 1 месяца при температуре -20 °C не теряя своей активности. Количества аллергена в одном флаконе достаточно для проведения 4 проб. Таким образом, для исследования ВАТ с использованием стандартизованных коммерческих аллергенов необходимо набирать группы из четырех обследуемых при условии постановки теста с одной концентрацией аллергена.

Для некоторых аллергенов известны стандартные концентрации – их достаточно ограниченный перечень приведен в приложении к согласительному документу EAACI по применению ВАТ в аллергологии [16]. Лекарственные средства обычно разводят в 5-25 раз [2], чаще в соотношении 1:25, но некоторые 1:250. По возможности следует использовать чистые активные ингредиенты или лекарственные препараты для инъекций, вводимых внутривенно, поскольку солюбилизированные таблетки представляют собой сложные смеси активных и вспомогательных веществ [2]. Некоторые препараты нестабильны и метаболизируются в растворе, поэтому аллергены должны быть приготовлены в свежем виде для каждого теста. Воздействие света является критическим фактором для результатов ВАТ при использовании фотолабильных препаратов, таких как моксифлоксацин [17]. Отрицательный тест с исходным лекарственным средством не исключает реакции пациента на метаболит лекарственного средства [18]. Токсичность и неспецифическую активацию следует оценивать для каждого тестируемого вещества. Белковые аллергены могут быть разбавлены до концентраций 10⁻⁵ — 10⁻¹⁵ [2].

Показатели и интерпретация 

Существует два основных показателя активности базофилов: реактивность и чувствительность. Реактивность — количество базофилов, которые ответили на определенный стимул [19]. Измеряется с одной или двумя концентрациями аллергена. После подтверждения реактивности может быть произведена оценка чувствительности базофилов. Чувствительность базофилов – это концентрация аллергена, при которой активируется половина всех реактивных базофилов [1]. Для этого необходимо произвести измерение с 6-8 концентрациями аллергена [20]. Таким образом, определение чувствительности базофилов требует значительного количества реагентов и в виду их высокой стоимости данное исследование рутинно не проводится в российских клинико-диагностических лабораториях.

При оценке выполнения теста результаты пациентов, не ответивших на стимуляции, следует относить к нонреспондерам и рассматривать, как ложноотрицательные [2]. По разным данным от 5 до 15% населения являются нонреспондерами. Невозможно сделать никаких выводов относительно реакций, вызванных аллергеном, у данной группы обследуемых. Нонреспондеры могут испытывать симптомы аллергических заболеваний и иметь положительные результаты кожных проб с соответствующими аллергенами. Нонреспондеры невосприимчивы к стимуляции через FceRI в стандартных условиях BAT, это явление связано с различиями во внутриклеточных сигнальных путях [21, 22].

ВАТ в алгоритме диагностики аллергических заболеваний

В общем алгоритме диагностики аллергии, представленном в согласительном документе EAACI посвященном клиническому применению ВАТ, указывается на необходимость собрать анамнез пациента с попыткой определить источник аллергена и оценить тяжесть аллергической реакции. Аллергическая реакция должна быть подтверждена объективным тестом, в идеале в течение 1 года после последнего воздействия, вызвавшего симптомы [14,15]. Тесты первой линии включают в себя определение специфического IgE в сыворотке крови, кожный прик-тест, а в отношении яда насекомых и лекарственной аллергии — внутрикожный тест. Однако, у очень небольшого числа пациентов (30 из 100 000) кожный прик-тест и интрадермальный тест могут вызвать системные реакции, если аллергическая реакция была действительно тяжелой [23,24]. Измерение уровня специфического IgE может оказаться невозможным, если аллерген недоступен в качестве стандартного реагента, и может иметь ограниченную ценность в зависимости от характеристик доступных реагентов. Измерение уровня специфического IgE и положительный результат кожных проб указывают на сенсибилизацию, но не являются клинически значимыми сами по себе [2].

ВАТ в диагностике лекарственной аллергии

Диагностическое исследование гиперчувствительности к лекарственным аллергенам направлено на выявление причинно-значимого аллергена и определение безопасного альтернативного препарата. Это особенно важно при диагностике аллергии на препараты, используемые для анестезии, когда провокационное тестирование невозможно, непрактично или неэтично [2]. Часть лекарственных средств невозможно использовать для определения специфических IgE, так как связывание их молекул или метаболитов в твердую фазу невозможно [25]. 

Патогенез не IgE-опосредованных анафилактоидных реакций изучен не до конца. Эти реакции могут быть следствием опосредованной комплиментом или прямой активации, а также гиперосмолярности, что встречается при применении рентгеноконтрастных препаратов и препаратов для общей анестезии [26,27]. Эти реакции могут быть смоделированы и выявлены с помощью ВАТ. 

Важно отметить, что BAT дает положительные результаты у 40% пациентов с системной реакцией в анамнезе и отрицательным результатом кожных проб, но положительным результатом провокационной пробы. Тест активации базофилов имеет хорошую прогностическую ценность отрицательного результата, полезен при принятии решения о проведении провокационного теста. ВАТ представляет высокую ценность для диагностики лекарственной гиперчувствительности к препаратам для которых отсутствуют другие in vitro тесты, а кожные пробы недоступны, ненадежны или дают неоднозначные результаты [2].

Таким образом, тест активации базофилов – это дополнительный инструмент диагностики лекарственной аллергии, который безопаснее, мягче и дешевле, чем провокационный тест, а в некоторых случаях является единственным доступным диагностическим инструментом [2].

BAT в диагностике хронической крапивницы

Хроническая спонтанная крапивница все чаще рассматривается как аутоиммунное (аутореактивное) заболевание. Проведенные за последние десятилетия исследования в области патогенеза ХСК дали основания выделить 2 эндотипа аутоиммунной крапивницы: аутоиммунная (аутоаллергическая) ХСК I типа, обусловленная наличием ауто-IgE антител к аутоантигенам, преимущественно к ТПО, ДНК и ИЛ-24; аутоиммунная ХСК типа IIb, которая характеризуется наличием ауто-IgG антител против высокоафинного IgE-рецептора FcƐRI и ауто-IgG против IgE [28].

В настоящее время единственными общедоступными методами для выявления аутоантител к IgE или аутоантител к FcƐR1 являются кожный тест с аутологичной сывороткой (ASST) и тест активации базофилов сывороткой больного крапивницей (BATs). ASST — это неспецифический скрининг-тест, который помогает оценить наличие в сыворотке крови гистамин-рилизинг факторов любого типа, а не только гистамин-рилизинг аутоантител, поэтому он используется для первого этапа диагностики аутоиммунной крапивницы. BATs определяет активацию маркеров базофилов донора в ответ на стимуляцию сывороткой крови пациентов с ХСК. Тест активации базофилов с активацией CD63 в качестве маркера активации для ХК был признан как специфическая, чувствительная и безопасная альтернатива in vitro для обнаружения функциональных аутоантител [31,32]. Этот тест применяется для второго этапа диагностики аутоиммунной крапивницы, а также может помочь оценить активность заболевания у пациентов с крапивницей. В отличии от ASST при диагностике ХСК с помощью ВАТ нет необходимости прерывать лечение антигистаминными препаратами, так как они не влияют на результаты теста. Кроме того, BATs используется в качестве маркера чувствительности к циклоспорину А или омализумабу [29,30]. 

Основной проблемой является неоднородность результатов, так как для анализа используются базофилы цельной крови разных доноров. Одним из вариантов решения данной проблемы является титрованное добавление ИЛ-3 [31]. Тест активации базофилов с аутологичными базофилами не проводят, так как пациенты с ХК часто являются нонреспондерами или слабо реагируют на перекрестное связывание IgE и нередко имеют симптоматическую базопению [33,34].

ВАТ в диагностике пищевой аллергии

Несмотря на широкое распространение кожных prick-тестов и определения специфических IgE к пищевым аллергенам и их компонентам, тест активации базофилов имеет хорошие перспективы рутинного применения для диагностики пищевой аллергии. Некоторые исследования демонстрируют более высокую точность ВАТ в сравнении с кожными тестами и определением специфических IgE к пищевым аллергенам [35-37]. 

Известно, что некоторые варианты пищевой аллергии при условии соблюдения строгой элиминационной диеты, со временем разрешаются. Тест активации базофилов полезен для оценки естественного разрешения пищевой аллергии и определении того момента, когда пищевой аллерген может быть безопасно повторно введен в рацион.

Представляется, что ВАТ целесообразно использовать в следующих случаях:

• Кожные тесты недоступны; 
• Известно, что аллерген дает ложноположительные результаты при использовании в качестве диагностического аллергена при кожном тестировании;
• Симптомы в анамнезе пациента указывают на высокий риск системной реакции при тестировании in vivo;
• Пациент принимает иАПФ и β-блокаторы, что связано с повышенным риском анафилаксии [38]; 
• Нет источника аллергена, который можно было бы использовать для кожного тестирования или определения специфического IgE;
• Имеется несоответствие между анамнезом пациента и кожными аллергопробами или уровнем специфических IgE;
• Как дополнение к определению специфических IgE в тех случаях, когда известно об их низкой чувствительности;
• Планируется проведение провокационного теста;
• Диагностика аутоиммунной формы хронической крапивницы;
• Необходима диагностика инсектной аллергии у пациента с мастоцитозом [39];
• Планируется введение пищевого продукта после окончания элиминационной диеты;
• Необходимо оценить эффективность АСИТ или анти-IgE терапии;
• Обследование пациентов с отягощенным аллергоанамнезом непосредственно перед проведением исследований с йодсодержащим рентгеноконтрастным препаратом [40].